iGEM暑期文献分享（2）：设计无需DSB和供体DNA的基因编辑技术

Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA

设计无需DSB和供体DNA的基因编辑技术

01、设计背景

目前，大多数基因突变导致的疾病很难同时达到无副作用的有效治疗。新兴的基因编辑治疗技术具有一定的局限性。由DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）刺激的同源定向修复（homology directed repair, HDR）由于依赖供体DNA，通常会通过DSB的末端修复产生过量的插入和缺失突变（InDels）；碱基编辑存在碱基过渡转换类型的局限性且在一定程度上依赖DSB。本文介绍一种“搜索和替换”（Prime Editing, PE）基因组编辑技术，它介导人类细胞中的靶向插入、缺失所以12种可能碱基间转换以及其组合，而不需要DSBs和供体DNA。

图1 Cinvar已知的人类致病基因突变

02、设计内容

1、PE的结构

先导编辑系统（prime editor, PE）由逆转录酶（RT）区域、pegRNA和Cas9切割区域组成。编辑范围包括：所有四个过渡点突变、转位点突变、插入、删除或以上的复合形式。

图2. 主编辑器

2、PE的作用机理

pegRNA上的间隔序列与目标DNA位点杂交，Cas9对其中一条链进行定点切割。PegRNA既有指定DNA目标序列，也包含新的遗传信息。从pegRNA的3’端启动逆转录插入新的遗传信息。由此产生了一个异双链，之后结构特异性内切酶可以切割滞后链DNA合成和长贴片碱基切除修复过程种产生的5’端，多余的5’未编辑的DNA可以被5’外切酶切除。最后通过DNA修复，将编辑链中的信息复制到互补链上来解决异双链的问题，将信息永久存在DNA上。

图3 PE的作用机理

03、PE的更迭

PE1、融合到Cas9（H840A）镍酶C端的M-MLV RT

PE2、M-MLV RT的突变可以提高编辑效率。研究在高温下支持逆转录的M-MLV RT变异——D200N、L603W、T330P、T306K和W313F。在PE1装置中加入这些变体，发现编辑效率普遍提高。将该五聚体逆转录并入PE1【Cas9(H840A)-M-MLVRT(D200N/ L603W/T330P/T306K/W313F】

图4 PE1和PE2在pegRNA指定的基因组位点上突变结果

上图实验为测试PE1和PE2在pegRNA指定的另外四个基因组位点上引入转位点突变的能力以及HEK3位点的靶向插入和缺失。

结果表明，PE2安装单核苷酸转位、插入和缺失突变，其效率明显高于PE1，并与较短的PBS序列兼容。

PE3、DNA修复效率也决定编辑效率。非编辑的DNA链需要进行切割而进行修复，这一过程容易与编辑DNA链形成DSB。测试非编辑链上的各种切割位置，以减少导致InDels的DSB。首先在HEK293T细胞的5个基因组位点测试了这种策略，指定为PE3，使用sgRNAs诱导距离pegrna诱导的缺口位点14-116nt的缺口。

图5 互补链缺口位置对编辑效率的影响

在测试的5个位点中，有4个，与PE2相比，切割未编辑链的编辑效率提高。最佳的缺口位置根据基因组位点的不同而不同，但距离pegRNA诱导的缺口约40-90bp的编辑缺口通常会提高编辑效率，而没有形成过量的indel。

PE3b、为实现在编辑链分解后才切割未编辑的链，减少同时切割，设计与编辑链相匹配的间隔子的sgRNAs，而不是原始等位基因，称为PE3b。适合应用于当编辑位于第二个原间隔子内时。

图6 PE3和PE3b在两个基因组编辑效率的比较

与PE3相比，PE3b的平均InDels数量减少，但编辑效率没有明显下降。

04、与碱基编辑的比较及致病突变的应用

经测试，在四种人类细胞系中，HDR的编辑效率通常比PE3的编辑效率低。

图7 HDR在四类细胞的编辑效率

图8 PE3在四类细胞的编辑效率

在HEK293T细胞中，PE3安装或纠正编码HBB（E6V）或安装编码PRNP（G127V）的等位基因的编辑与indels的比率平均是cas9启动的HDR的270倍。在除HEK293T外的人类细胞系中，PE3和HDR之间的比较显示了类似的结果，尽管PE3的编辑效率较低。

图9 PE在HEK3基因组的编辑应用

在HEK293T细胞中使用PE3精确插入HEK3 a His6标签，Flag表位标签和扩展的Cre重组酶loxP位点，且indels为3.0-5.9%。这表明可以有效和精确地将新的DNA序列插入活细胞的靶位点。