文献标题：
Development of Escherichia coli Nissle 1917 derivative by CRISPR/Cas9 and application for gamma-aminobutyric acid (GABA) production in antibiotic-free system
网址：
https://doi.org/10.1016/j.bej.2021.107952
关键词：
Escherichia coli Nissle 1917; Cryptic plasmid; CRISPR/Cas9; Gamma-aminobutyric acid; GABA; Antibiotic-free
主要内容：
一、前言
EcN 作为一种对肠道有益、不致病的大肠杆菌，有很广泛的应用前景。然而，研究发现，野生型 EcN 体内含两种高度稳定的隐性质粒，即 pMUT1（NCBI号MW240712，3.2kb）和 pMUT2（NCBI号CP023342，5.6kb）。由于这两种质粒的存在，导致其作为工程菌的潜力受到限制。不仅异源基因表达受限制，蛋白质表达的效果也不佳，而因为质粒不相容的原因，外源质粒也很难能够转入其中并成功表达。
另一个研究团队发现，利用 CRISPR/Cas 9 技术消除EcN中一个隐性质粒，能够使得外源蛋白的表达强度有所提升，因此，本研究团队打算利用 CRISPR/Cas9 技术消除 pMUT1 和 pMUT2，得到不含质粒的 EcN 衍生菌株 EcNP。
CRISPR/Cas9 是一种基于细菌对入侵者的防御机制的基因组编辑工具，由于其高度准确的 DNA 目标定位特性和成熟的分子工具，已被广泛应用。其中，sgRNA 序列是 CRISPR/Cas9 系统中的关键因素，使 Cas9 酶能够识别和切割目标 DNA。双sgRNA 设计为 Cas9 提供了两个独特的染色体基因缺失靶点，同时也降低了细胞内的 SOS 反应，从而提高了基因编辑能力和效率。
*备注：质粒固化（plasmid curing）是指消除细菌中质粒编码的功能，如抗生素抗性、毒力、芳香化合物的降解等的过程。文献中已经报道了几种质粒固化剂，然而，没有一种质粒固化剂能够消除不同宿主的所有质粒。在质粒稳定或性质损失难以确定的情况下，可以用固化剂处理细菌。这些包括化学和物理试剂，其中一些可以使 DNA 发生突变，特别干扰其复制，或影响细菌细胞的特定结构成分或酶。
图1：pMUT1 和 pMUT2 的图谱
二、研究思路
研究者们首先发现消除一个 pMUT1 或 pMUT2 可以提高异源基因和蛋白的表达，因此为进行比对，他们在本项研究中先构建了如下的突变体。
图2：本项研究中构建的基础突变体菌株
为了实现质粒的消除，他们在 pCas9-KT 的基础上插入了不同的 sgRNA。这是针对每一个隐质粒设计了一对 sgRNA 序列，其目的是为了将质粒切割成两段，使其难以再次愈合，从而达到质粒消除的作用。
另外，为了研究 EcN 和 EcNP 菌株中异源基因的表达情况，他们又在两种菌株中以不同强度的J系列启动子进行测试。接下来，他们还开发了以 pMUT1 和 pMUT2 为基础的新载体，即 pMT1 和 pMT2，并对其稳定性进行研究，考察其作为一个载体的可能性。最后他们利用 pMT1 和 pMT2，在EcNP中尝试表达gadB基因，成功合成了γ-氨基丁酸 (Gamma-aminobutyric acid，GABA)。
本次阅读主要着重于学习如何利用 CRISPR/Cas9 消除 EcN 的两个质粒，以及其相关的验证等一系列操作。
三、材料与方法
为了消除 pMUT1 和 pMUT2，他们构建了一个 pCas9-KT 质粒，并针对不同的用处做出了不同的改变，产生三个衍生物。
图3：pCas9-KT 的衍生质粒
*备注：Km- kanamycin 卡那霉素
sgRNA：small guide RNA 小向导RNA
ori101/repA101ts：一个对温度敏感的复制原点（在37℃下丢失）
载体质粒消除系统的方法如下：
1.首先构建一个含 Cas9 片段、温度敏感起点（ori101/repA101ts）、Km 抗性的 pCas9-KT 质粒。
2.设计 sgRNA 片段，这个 sgRNA 片段两侧含两个 BsaI 酶切位点。sgRNA 的设计是针对不同目标质粒（pMUT1 或 pMUT2）来修改的。
图4：三种 sgRNA 的设计
3. 通过在 Bsa I 位点酶切和酶连，将这些合成的 sgRNA 序列克隆到 pCas9-KT 中，以生成三个质粒 pCK-sgM12、pCK-sgM1 和 pCK-sgM2。
4. 构建好质粒后，将质粒通过化学转化，转入 EcN 中，以无抗 LB 平板涂板，培养过夜。
5. 进行菌落 PCR，随后以 1.8 % 的琼脂糖凝胶验证 PCR 产物。
图5：pCas9-KT 与其三个衍生质粒的构建情况
四、结果
菌落PCR跑胶情况如下图所示。
图6
其中，M 为 10kb 的 marker，泳道1为野生EcN PCR结果；泳道为转入 pCas9-KT 的 EcN；泳道 3为 EcNP（即去除了 pMUT1 和 pMUT2）；泳道 4为 EcNP1（去除了 pMUT2）；泳道 5为 EcNP2（pMUT1 已移除）。箭头表示 pMUT1 和 pMUT2 质粒。
DNA 电泳结果表明，利用研究者们设计的方法，EcN 中的两个隐性质粒均被去除形成了 EcNP，而 EcNP1 和 EcNP2 中分别仅存在 pMUT1 和 pMUT2。这种方法可以同时消除两种隐性质粒，效率高，时间短（小于7天）。
此外，研究者们将不同的J 系列启动子连接 sfGFP 荧光蛋白基因后，导入 EcN 和 EcNP 中表达（J 系列启动子的强度顺序为 J23100 > J23105 > J23114 > J23109），其强度结果测试与 DH5α 中的测试结果一致，且结果表明 EcNP 中 J 系列启动子的表达普遍比 EcN 更强。为了进一步确认质粒的拷贝数（plasmid copy number, PCN）是否影响异源基因的表达情况，将具有不同复制起点的最常见质粒（即pUC、pMB1 和p15A）转化为 EcN 和EcNP 以进行比较。结果表明，EcNP 中的 PCN 高于 EcN 和其他大肠杆菌。
总结来说，一系列测试表明，消除了两个隐性质粒 pMUT1 和 pMUT2 的 EcNP 在异源基因的表达上有更大的优势。
个人评价：
从本篇文献中学习了利用 CRISPR/Cas9 消除 E. coli Nissle 1917 的方法，找到了外源质粒无法转入 E .coli Nissle 1917 的解决办法。后续将以本篇文献为根据，并在师兄指导下完成 E .coli Nissle 1917 的改造，方便后续的其他操作。
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