iGEM 2024文献分享 | 遗传电路的快速可调平移后耦合

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文献标题：Rapid and tunable post-translational coupling of genetic circuits

网址：https://doi.org/10.1038/nature13238

关键词：肽标签SsrA及其变体遗传回路快速可控调节

主要内容

这篇文章主要研究了遗传电路的翻译后调控方式。研究者使用了一个含有羧基末端的ssrA标签构建融合蛋白，在大肠杆菌内实现快速降解，从而实现遗传回路的快速调控。此外，他们还尝试在CFP和LAA标签之间插入不同的TS重复插入物来构建TS构建物。通过这些构建方式的尝试，研究者实现了快速和可调节的遗传模块耦合。

1. 背景

遗传回路的构建需要考虑各个回路模块间通信的快速和精确。研究者发现，可以使用细菌内源性蛋白降解途径来实现遗传回路各组分的精确、动态调控，同时兼顾系统的稳定性，这是基于SsrA（LAA型） Tag来实现的，带有该标签的蛋白质会被引入大肠杆菌蛋白质降解途径。

本文应用了ClpXP蛋白酶的底物降解竞争机制来设计时间和空间尺度上的遗传调控回路，所有带有于SsrA（LAA型）Tag的被调控组分会通过竞争有限数量的ClpXP蛋白酶来实现动态连接，举一个不太恰当的例子，就像是溶剂的拉平效应。该调控回路的耦合延迟时间比基于转录因子的耦合时间快一个数量级以上（如果转录因子的延迟时间在20-40分钟的话，基于降解的调控方法延迟时间小于1分钟）。

不仅如此，研究者还在原有降解标签序列的基础上，在被标记蛋白质和标签之间添加一系列可变长度的间隔区来构建降解标签库。这个间隔区包含氨基酸序列“Thr-Ser”（TS）的1至5个拷贝，它们的降解能力和间隔序列长度成反比，为偶联回路的偶联强度和时间带来更多选择。

2. 实验方法

2.1菌株和质粒

通过PCR反应将已有的LuxR/I系统和报告基因进行融合蛋白和基因回路构建，除了luxR外，所有的基因都通过PCR添加各种ssrA标签（AANDENYALAA）进行标记。激活子和报告元件（LuxI、CFP和YFP）放置在一个载体上，抑制元件（AiiA和LacI）放置在另一个载体上。

2.2数据分析：微流控技术和显微镜

微流控技术方面，研究者使用了一种能够混合或切换两种不同培养基的微流控装置，可以控制稀释培养物的流速从而控制菌落密度。研究者同时使用了尼康TI显微镜，并使用Photometrics CoolSnap冷却CCD相机Photometrics QuantEM EMCCD相机进行图像采集，让细胞直接在微流控装置内进行成像。再结合自己开发的算法和内置的MATLAB函数从时间尺度上获取单个细胞和菌落的荧光强度变化轨迹。通过分析这些轨迹的峰/谷值，计算震荡周期和振幅等参数。

3.标签降解响应

为了直接说明通过调节ClpXP对蛋白质降解的活性来协调模块输出可以实现响应，研究者使用低水平(90 mM)的、外部提供的H2O2“诱导剂”快速(2分钟)调节组成型表达的GFP-LAA浓度，表征了标签响应降解的时间。

因为H2O2能够阻断RssB与ClpXP的结合，减少了ClpXP的天然底物负荷，其中RssB是一种靶向替代sigma因子RpoS被ClpXP降解的一种蛋白质，当该蛋白质大量失活时，使得ClpXP对标记SsrA（LAA型） Tag的有效降解率瞬间增加，所以可以从荧光强度的衰减时长和衰减强度来看SsrA（LAA型） Tag的诱导降解性能。

Figure 1 调整RssB浓度后标签响应降解的时间和强度

4.耦合的尝试调控

4.1 单一种类标签的两模块耦合

为了设计能够产生自身动力学的遗传模块之间的耦合，研究者设计了一个包含群体感应系统和Lac启动子的诱导型调控系统的基因回路。其中诱导型调控系统使用原始简单遗传结构，通过异丙基-b- d -1-硫代半乳糖苷(IPTG)和阿拉伯糖进行调节。

Figure 2 用于耦合的两个不同输入信号的诱导型回路

使用小型微流体装置(单次100个细胞)来控制群体感应响应时间（通过控制细胞数量来间接控制）。而在较大的流控装置(5,000个细胞)中观察到，随着种群的增长，实现了单一回路振荡到以群体感应为基础的同步振荡过程（有强度上的振荡行为是因为在菌株和质粒构建的过程中引入了负反馈调控元件）的过渡。

Figure 3 细菌内部振荡和群体感应振荡行为的偶联

在较大种群的情况下，ClpXP上的底物负荷足以将细胞内时钟移出其本身的振荡状态，从而实现两个时钟之间在时间上和空间上的耦连，尽管原来它们的空间和时间尺度截然不同。因此，尽管没有引入新的细胞-细胞通信模式，通过clpxp介导的降解耦合，也能够实现细胞本身的行为和菌落整体行为的同步。

4.2诱导信号强度对耦合强度的影响

研究者通过调整IPTG的诱导浓度来观察两种诱导系统的耦合周期数变化，从而评价耦合强度，发现当IPTG浓度增加时，细胞内的振荡更容易在群感系统响应时实现更为快速的耦合，这表现为单细胞内振荡时间的缩短和群体振荡时间的延长。

Figure 4 细菌内部振荡和群体感应振荡行为耦合强度随IPTG浓度的改变

4.3不同标签库的功能表征（耦连延迟）

为了表征使用翻译后耦合机制对下游模块的驱动能力，研究者通过添加相同或不同的LAA标签将群体感应系统表达的荧光蛋白GFP和普通诱导表达系统控制的CFP荧光蛋白分别进行控制。当两种系统实现耦合能够成功表征后，改变CFP的降解标签，通过在标签之前添加变长连接子(Thr-Ser (TS)重复)，随后研究者使用4.1中同样的测定方法表征了降解动力学的相移，并发现较长的连接子会产生较长的延迟，说明更长的标签具有更弱的降解竞争能力。

Figure 5.a-c左：Thr-Ser (TS)单重复带来的延迟
中：延迟时间与连接子拷贝数的关系
右：延迟响应时间的比较

4.4 排除单一诱导信号的影响直接测定耦合强度

因为ClpXP的活性会受到天然底物RssB浓度的影响，而先前使用过氧化氢能够实现RssB的迅速失活，从而在短时间内提升ClpXP活性，最终对耦合回路的响应强度和响应时间带来明显的影响。

Figure 6 过氧化氢的加入对耦合回路的耦合强度和响应时间的影响

我们可以看出，在加入过氧化氢之后，荧光强度峰值明显提升，同时峰宽更窄，实现了更强、更迅速的调控。

小结

通过蛋白质降解的优势可以总结为以下几点：

（1）特异性：

选择性降解：标签不仅能实现选择性的降解，同时又不会干扰蛋白酶原本的天然负载底物和其它未连接标签的组分。这种特性可以帮助我们更好地控制遗传回路中特定基因的表达。

精准调控：通过调控蛋白酶的活性和竞争关系，让降解的“排队”过程来实现精准而快速的调控，从而控制遗传回路中不同组分的稳定性和表达水平，实现特定功能的发挥。

（2）效率：

快速响应：蛋白酶竞争相比于转录因子调控，可以实现更为快速的响应，通过蛋白酶的降解活性来调控是比合成活性更为快速的调控策略，从而更好动态调整回路。