iGEM课题分享——2023 SZU-China

iGEM课题分享PolycoBeadiGEM 2023 SZU-China

Ⅰ.获奖情况

在2023年iGEM大赛中，SZU-China荣获金奖并斩获TOP10大奖以及最佳农业课题、最佳部件收集、最佳基础部件、最佳网页提名四项单项奖项。

Ⅱ.背景

番茄在全球农作物中占有重要地位。灰霉病会在收获后的贮运过程加速作物的变质， 造成严重的物流损失。灰霉菌通过菌核和分生孢子潜伏并传播感染番茄等作物，目前的防治手段主要是通过化学农药进行防治，但存在时效短、污染环境、农药残留等问题。

因此，SZU-China团队设计了一种名为PolycoBead的产品。该产品灵感来源于洗衣凝珠，其外膜为可水解水溶性聚乙烯醇（PVA）薄膜，内部分为两种体系，其一是负责实现RNA干扰的CPP-shRNA，另一部分则是负责刺激植物免疫的经改造枯草芽孢杆菌。

Ⅲ.Design

1.通过构建shRNA实现RNAi技术

RNAi技术：shRNA由Dicer或Dicer-like加工成siRNA,与Ago蛋白结合形成RNAi沉默复合物（RISC），与mRNA结合使mRNA被降解或阻止翻译。

RNAi技术优点：

特异性靶向：仅靶向和沉默灰芽孢杆菌的必需基因，而不会引起对其他生物的伤害。

环境友好型：RNAi分子容易降解，因此对环境友好。

可控：RNAi 生物农药不会引起植物基因表达的永久性变化且受人为控制。

靶向位点：

Bcpme1：B.cinerea 表达PME的重要基因，果胶甲基酯酶（PME）是一种水解酶，可催化植物细胞中果胶分子上的α酯键水解，而果胶是植物细胞壁的主要成分之一。

BcOAH：在感染期间，灰芽孢杆菌会表达草酰乙酸水解酶，催化草酰乙酸在B. cinerea中转化为草酸。草酸进入宿主植物，宿主中的游离钙离子可形成草酸钙结晶，容易引起植物堵塞的症状。草酸的释放还可以抑制活性氧（ROS）的爆发，不利于植物免疫防御，BcOAH能够帮助产生草酸。

BcDCL1 和 BcDCL2：灰芽孢杆菌的二分体蛋白DCL1和DCL2参与siRNA的合成。然后siRNA将被递送至宿主植物细胞以参与RISC复合物在宿主RNAi机制中的形成， 随后沉默和抑制宿主免疫相关 基因，使植物细胞更容易受到感染。

Bccyp51：麦角甾醇 （ERG） 是一种 C28 甾醇，存在于真菌细胞膜中，负责维持膜的流动性， 调节膜通透性，影响膜相关酶活性，并影响真菌细胞生长。

BcCHSIIIa：几丁质合酶基因，几丁质是真菌细胞的主要结构成分。

对以上靶向基因及对应的shRNA进行查询比对，保证生物安全性。

2.shRNA分子的递送

单独的shRNA分子无法有效进入靶标 细胞并发挥其作用。

CPP：是一种短链氨基酸，由约30种氨基酸组成，包括碱性氨基酸和 R 基团，可用于递送生物分子如siRNA、pDNA、质粒和蛋白质。工程化CPP和shRNA分子通过带正电荷的氨基酸残基相互作用，如精氨酸和赖氨酸与磷酸盐骨架带负电荷的核酸形成亚微米肽-核酸复合物。

BP100-(KH)9是一种高效融合的具有BP100 域名的生物分子结合的细胞穿透肽 ，KH9提高生物分子进入植物细胞的交付效率。BP100-(KH)9在分子力显微镜（AFM）下显现球形，可以包裹shRNA分子形成球形复合物。

BP100-(KH)9组合shRNA简单，将两种物质按一定比例混合，让它们在室温下静置一段时间，即可获得 CPP-shRNA的复合物。这种非共价结合方法具有稳定性和可逆性，从而实现转移和生物分子的功能。

串联shRNA分子：

对于RNAi所可能发生的效果不佳，靶序列脱靶等问题，SZU采用了串联多个RNAi分子的机制来解决这些问题。串联后的RNAi有效率更高，在计量更低的情况下达到了更好的作用效果。

3.植物免疫途径

植物免疫途径分为两种，Pathogen-associated molecular patterns Triggered Immunity (PTI)和Effector Triggered Immunity (ETI)两种。

PTI：植物与病原物发生相互作用时，植物细胞膜上的模式识别受体（PRRs） ，可以识别病原物产生的保守的病原偶联分子模式（PAMPs） ，并进一步引起一系列的级联应答反应，使植物发生针对PAMPs的防御反应，称之为PAMPs激发的免疫反应（PTI），也称之为基础免疫反应。PAMPs是病原物在进化过程中非常保守的一类分子，例如几丁质、脂多糖、肤聚糖、鞭毛蛋白等。植物体表面的PRRs正是可以识别这些保守的PAMPs，进而激活PTI，构成了植物防御的第一道防线。另外，在病原侵入植物后，被病原物入侵后降解产生的植物角质层碎片和细胞壁碎片也可以作为危险相关分子模式（DAMPS）被PRRs识别，激活PTI。

ETI：在植物和病原体协同进化的过程中，病原体通过自身的分泌系统分泌效应因子（ Effector）进入外质体或者直接进入植物细胞，帮助病原体克服植物的基础免疫反应，完成对植物的侵染。病原体通过效应因子引起的植物感病的现象称为效应因子激发的感病反应（ETS）。针对效应因子的出现，植物也进化出了一类基因，称之为R基因，其编码的蛋白可以直接或间接识别效应因子，引起植物体内活性氧的产生、钙离子浓度的升高、MAPK级联反应的激活以及相关防卫基因的表达等一系列反应，对抗效应因子引起的致病反应起到抑制的作用。这类免疫反应称为R基因介导的免疫反应，也称为效应因子激发的免疫反应（ETI）。

对比：相比植物的基础免疫，效应因子激发的免疫反应的反应强度更大，抗病效果也更加明显。伴随着ETI的发生，植物被病原物侵染的部位经常会发生局部的细胞程序化死亡（PCD），引发植物对病原物的超敏反应（HR），使病原物不能在侵入部位获取相应养分，以及诱导周围细胞合成抑制病原物生长所需物质，最终抑制病原物的进一步蔓延。

诱导因子选择：

BvEP：一种来自Bacillus velezensis LJ02的蛋白磷酸化酶

flg22：铜绿假单胞菌鞭毛蛋白具有22个氨基酸的N末端肽

4.工程枯草芽孢杆菌

改造：BvEP的核酸序列具有与枯草芽孢杆菌具有高度同源性，枯草芽孢杆菌具有简单的遗传背景和强大的蛋白质表达系统。因此，在枯草芽孢杆菌同时表达蛋白质免疫诱导因子BvEP和Flg22来诱发植物免疫可能实现1+1>2的效果。

使用强启动子Pveg表达免疫诱导因子BvEP。Pveg是枯草芽孢杆菌中连续表达靶基因的启动子，包含两个枯草芽孢杆菌主要σ因子a1的结合位点，可以使基因有效表达。同时，选择2x Fd终止子作为表达通路的终点。

自杀开关：

通过对蔗糖的浓度的调控进而调控工程菌的自杀。

该自杀系统使用MazE与mazF作为自杀的毒性基因，当蔗糖浓度较高时，PsacB得以转录翻译出mazE进而与mazF结合解毒，当蔗糖浓度不够时，mazE不足以结合mazF，从而使得mazF通过切割mRNA阻断细菌中蛋白的合成，从而导致细菌的生长抑制和死亡。

5.产品PolycoBead

根据综合人类实践，农药滥用是当今农业中普遍存在的问题。当农民施用杀虫剂时，农药制剂农民可以在市场上购买通常容量大，并且即使农药的最佳施用量是标明在包装或使用说明书上，农民会主观添加过量，导致增加农作物中的农药残留，甚至扩散到环境中。此外，由于RNAi生物农药的不稳定性，RNA分子很容易被环境中的核酸酶降解，因此非常有必要将RNAi生物农药与环境，从而减少和避免RNA降解。

Polycobead采用高醇解度的水溶性聚乙烯醇（PVA） 作为外膜，将我们的CPP-shRNA 制剂和工程枯草芽孢杆菌包裹在一起，形成凝珠。由于PVA薄膜是水溶性材料，当农民使用我们的Polycobead，他们只需要把它放进一定体积的水中，并且快速溶解后可直接喷入田间。

优点：

·常温下能快速溶解

·能自然降解

·溶解后能改善土壤条件

·机械强度高

·能避免RNA降解

·容易获得

Ⅳ.Result

1.shRNA分子

总共选择了 6 个靶基因作为的 RNAi 沉默目标。此外，还连接了 2 个靶向 shRNA B. cinerea的生存基因与特异性对ATGCCT进行测序，以构建名为shRNA（Box-survival）的bi-shRNA。还串起了4个靶向相关关键基因的 shRNA 在西红柿上的灰芽孢杆菌感染中，并将其命名为 shRNA(Box-infect)。

在选择了上述靶基因后，设计了相应的shRNA分子通过CDS序列的靶基因。在BLAST并确认其特异性后总核酸文库，通过XbaI限制性位点序列-检测RNAi片段-环- 反义 RNAi 片段 - BlpI 限制性位点，以及将其连接到pET-28a(+)质粒以获得我们的shRNA表达向量。

2.IPTG诱导生产进行质粒及shRNA验证

shRNA 表达载体成功转入且成功提取了预期大小的我们的 shRNA。

构建IPTG调控表达通路，验证所选的免疫诱导因子PehA， Flg22、3xFlg22 和 BvEP 可以激活植物免疫力。

不同重组质粒的条带 通过PCR扩增的都是预期的大小，表明质粒成功转化为大肠杆菌BL21（DE3）。

扫描电子显微镜下CPP包裹shRNA

3.蛋白质验证

测定后改善条件以增加蛋白质产量

通过SDS-PAGE证明已经成功表达

通过WESTERN-blot验证成功表达

4.DAB染色实验

PehA、1x flg22 和 3x flg22表达蛋白质的量太低，无法满足随后的DAB实验，因此在后来被放弃实验。

ROS的爆发是植物免疫激活的指标，因此进行了DAB染色实验，以检验不同浓度的BvEP处理后番茄叶片中ROS爆发的程度。DAB染色结果越暗，叶片中的ROS越多。在实验中，对照组1用清水处理，并对照组 2 用大肠杆菌 BL21（DE3）中提取的总蛋白处理，无需诱导。

（a）浸泡方法应用BvEP。低：10ug/ul，中：25ug/ml，高：50ug/ml。（b）滴法涂抹BvEP。低：40ug，中：100ug，高：200ug。

染色后，使用ImageJ软件进行灰度处理分析用两种不同的BvEP处理的叶子，量化免疫强度的方法，然后进行 t 检验确定不同BvEP之间的显著差异浓度。灰度较低，即棕色较多沉淀在叶子中，表明ROS的爆发更强。

从上图可以看出，无论使用浸泡或滴落方法，ROS的爆发程度叶子随着施用的BvEP浓度的增加而增加。

Ⅴ.HP

“5I循环”（灵感、构思、信息收集、 改进和互动，实施和想象）。

Ⅵ.Highlights

采用无细胞系统进行RNAi分子生产。

对硬件进行了改进，解决了实际生产中的部分问题并降低了成本。

采用工程菌＋RNAi的方式复合保护番茄植株，比单一保护方式更为有效。

产品应用方法非常简易。