2023 ZJU-China iGEM课题分享

iGEM课题分享 Flora Sentinel

2023 ZJU-China

获奖情况

在2023 iGEM比赛中，ZJU-China荣获金奖并斩获TOP 10大奖以及最佳建模、最佳农业课题、最佳植物合成生物学、最佳展示和最佳网页六项单项奖。

PARTⅠ Background

作物病虫害和杂草是维持稳定的农业生态系统的三大挑战，疾病暴发对全球粮食安全和环境可持续性构成重大风险，导致初级生产力和生物多样性的丧失。农业中的传统化学杀虫剂会带来许多危害。它们会危害人类健康，以及通过在空气中漂移，渗入土壤和水中，伤害有益生物来污染环境和生物多样性。过度使用还会导致杀虫剂耐药性。因此，浙江大学的团队提出了利用人工合成的基因通路与植物的先天免疫通路作用。开发一个更安全和更有效的生物杀虫剂，使植物能够拥有与人类相似的生物杀虫剂产品疫苗。

PARTⅡ Principle

一、植物免疫系统

植物拥有强大的先天免疫系统，包括PTI和ETI途径。PTI依赖细胞表面受体识别，而ETI依赖细胞内蛋白，例如NLR。病原体经常分泌阻碍PTI的效应器，使ETI对于长期植物防御和两种途径的整合至关重要。 因此，浙江大学的项目主要研究NLR及其在ETI途径中的作用。

图1 先天植物免疫通路：PTI和ETI

二、NLR蛋白

NLR家族、广泛存在于植物细胞。它们通过识别和防御在生物体的免疫系统中起着至关重要的作用，阻止寄生虫、病毒和细菌的入侵。

它们是植物细胞中的受体，可检测病原体效应物并启动免疫反应。它们分为受体NLR和信号NLR。受体NLR识别效应器，同时发出信号 NLR 触发器免疫反应。NLR结构由N端、NB-ARC和LRR结构域组成。每个域都有识别特定效应器的能力。

图2 NLR的结构和分类

三、ID序列

ID序列的结构与致病效应子的靶蛋白极其相似，使其能够竞争性结合效应子，成为免疫反应的有效识别方法。

当前的ID序列缺乏紧密的绑定和特异性。因此，浙江大学提出将ID序列替换为一个特殊的工程纳米抗体，能够精确地结合效应子，同时仍然保留募集能力。

图3 免疫受体修饰的机制

PARTⅢ Design

一、TLS序列

TLS已被发现具有运输RNA分子的能力，这种能力可以帮助在植物维管束中转运RNA分子。

为了让他们的RNA从农杆菌侵染部位扩散到整个植物，然后表达靶蛋白在整个植物中，浙江大学团队在RNA中添加TLS模块。

他们尝试了来自不同物种的不同氨基酸的TLS，并修改了它们的序列以找到几种对RNA迁移率最有帮助的序列。优化的添加了TLS的RNA可以在植物维管中移动，并在未转化的植物细胞中表达靶蛋白。

图4 TLS模块的结构和功能

二、RdRp模块

在疫苗中使用RNA的一个突出局限性是其固有的不稳定性，导致半衰期缩短。浙江大学团队将烟草花叶病毒(TMV)的复制酶组装到他们的RNA上。TMV是一种单链RNA病毒。TMV 的复制酶可以将基因组(+)RNA 转录为基因组(-)RNA。然后，基因组(-)RNA可以作为产生原始基因组RNA新拷贝的模板，也用于生产表达目标蛋白质的亚基因组RNA。因此，RdRp模块可以帮助延长RNA的半衰期，也增加了靶蛋白的表达时间。

图5 RdRp模块的功能

三、植物免疫模块

他们选择了NLR蛋白的两个基因，pikm1和pikm2。Pikm1是接收器，NLR负责识别；而Pikm2 是信号NLR，触发即时响应。

他们用纳米抗体代替ID序列，这种纳米抗体具有更强的特异性及结合能力，同时保留ID序列的原有功能。

由于需要传感器和辅助蛋白来激活植物免疫力，他们设计了两种功能性路径，位于两种不同类型的工程细菌中，以减少人工合成的影响工程细菌生长的基因。

图6 植物免疫模块

四、生物安全模块

在本模块中，他们设计了一种在农杆菌中表达的组成型启动子，实现了对农杆菌的调节。组成型启动子与光毒性蛋白协调细胞死亡，确保我们项目的安全性。

(1)光感应终止开关

他们首先选择KillerRed进行自杀。KillerRed 是一种产生活性氧(ROS)的红色荧光蛋白，在黄绿光下，可用作生物安全应用的终止开关。基于此，他们对蛋白进行了点突变，并验证了它是否具有更强的自杀开关效果。

此外，他们合成了优化的miniSOG基因，这是一个光毒性蛋白。光照后，miniSOG产生杀死细菌的氧气物质。为了在农杆菌中使用这种蛋白质，他们优化了它的密码子。

(2)增强子

他们尝试各种诱导型和组成型启动子，并选择最合适的一种作为自杀开关。最后，他们选择了组成型启动子50Spro，并对该启动子进行定向进化，使其强度更适合控制细菌的生物安全模块。

图7 生物安全模块

PARTⅣ Results

一、TLS模块验证

TLS基序的折叠结构触发了维管束植物中RNA的运动，且茎(8至12个核苷酸)-可变凸起–茎(4至7个核苷酸)-环结构对RNA的迁移至关重要。为了估计预测tRNA的二级结构，实验者对拟南芥的20个tRNA进行了二级结构预测(图8)，筛选出结构合适的tRNA：Met和Met ΔΔT。

图8 Met tRNA(A)，Met ΔΔT(B)， Ala tRNA(C)和His tRNA(D)二级结构预测

为了验证这两种tRNA的运输功能，用这两种tRNA的TLS构建质粒pGREENII-GFP-TLS，将质粒电转进入农杆菌后，通过农杆菌注入植物叶片的标记区域进行瞬时表达。结果显示，对于携带GFP的mRNA，注射区域外没有检测到明显的荧光信号光，却检测到了GFP mRNA(图9)，说明TLS能携带GFP mRNA进行迁移。

图9 注射区域外叶片样品的相对GFP mRNA水平

上述实验种注射区域外没有荧光信号的可能原因是GFP的荧光信号太弱，导致其无法检测到。因此又构建了质粒pGREENII-RUBY-TLS，在烟草叶片的标记区域进行瞬时表达。注射区域外有RUBY催化酪氨酸形成的紫红色斑点，注射区外也有RUBY mRNA的出现，但其迁移能力不如GFP mRNA(图10)，说明TLS能携带RUBY mRNA进行迁移，迁移的RUBY mRNA也能成功表达，RUBY mRNA迁移能力的减弱可能是由于RUBY mRNA(~4kbp)长于GFP mRNA(~800bp)。

图10 RUBY的可视化表达(A)和相对RUBY mRNA水平(B)

由于GFP mRNA和RUBY mRNA长度差异较大，实验者又决定将GUS作为报告基因。作者还希望研究其它TLS的迁移水平，于是构建了其它TLS的PGREENII-GUS-TLS质粒。结果显示，除了上述TLS之外，拟南芥的Ala tRNA也可以驱动mRNA运动(图11)。

图11 Ala tRNA驱动注射区域外叶片的GUS表征

二、RdRp模块验证

为了验证RdRp对于RNA的保持功能，他们首先构建了表达RdRp质粒，并用GFP进行表征。他们首先克隆了TMV全基因组进入 pGreenⅡ，用GFP基因替换TMV亚启动子CPORF，构建出质粒pGreenⅡ-RdRp-subPromoter CP-GFP，又用GFP基因替换TMV亚启动子MP的ORF，构建出另一个质粒pGreenⅡ-RdRp-subPromoter MP-GFP。

成功构建质粒后，用农杆菌转化烟草，在荧光显微镜下观察结果，发现相较于用CaMV 35s启动子直接表达GFP，表达RdRp的两组发出更强的荧光(图12)。之后，他们又检测了GFP蛋白的表达情况，通过荧光光谱法测定了GFP在叶片中总可溶性蛋白提取物中的含量，发现RdRp的表达显著增加了总可溶蛋白中的GFP的相对荧光强度(图13A)，通过Western Blot(WB)也证明了有RdRp存在时GFP的相对表达量升高(图13B)。此外，他们还通过RT-qPCR进行了GFP的mRNA含量检测，发现RdRp存在导致GFP mRNA含量增加(图14)。检测GFP的mRNA和蛋白质随时间的变化，发现RdRp的存在可以减缓mRNA和蛋白质的降解，延长mRNA和蛋白质的半衰期(图15)。上述结果均证明了RdRp可以发挥良好的复制作用并增加靶RNA的数量和表达水平。

图12 荧光显微镜下观察GFP的荧光强度

图13 通过荧光光谱法(A)和WB(B)检测GFP的蛋白表达强度

图14 GFP mRNA的相对含量检测

图15GFP mRNA的相对含量检测

接着，他们探究了TLS与RdRp融合对两者功能的影响。由于TLS的二级结构和TMV 3' UTR的二级结构对RNA的迁移和自我复制至关重要，他们预测了TLS与TMV 3' UTR融合后的二级结构，发现TLS与TMV 3' UTR的融合基本不影响两者的二级结构(图16)。然后，他们测定了RdRp和TLS融合后的迁移率变化，发现融合后TLS仍能行使迁移功能，而RdRp也能增强荧光强度(图17)。

图16 TLS与RdRp融合二级结构预测

图17 RdRp 和 TLS融合后的迁移率测定

三、植物免疫模块测定

实验者从含有具有Pikm抗性基因的水稻根中通过RT-PCR获得了pikm1和pikm2基因，又购买了GFP纳米抗体基因序列enhancer，用于替换Pikm1中的ID序列，构建了质粒pGreen-pikm2，pGreen-GFP，pGreen-pikm1 (enhancer)和Pgreen-TMV-GFP。用pikm-1(enhancer)+ pikm-2 + GFP(NLR*)作为实验组，pikm-1(enhancer)+ pikm-2 (NLR)作为对照组，空农杆菌作为阴性对照，GFP作为阳性对照，分别瞬时转化进入烟草叶中。

直接观察表型，发现与阳性对照相比，改造后NLR的转入可以显著降低叶片上能观察到的荧光(图18)。又对转化后的叶片进行总蛋白提取并检测荧光强度，发现改造后NLR也能降低总蛋白中的荧光强度(图19)。再使用WB对GFP蛋白进行检测，发现改造后NLR降低了GFP蛋白的表达量(图20)。上述结果显示，改造后的NLR能够中和GFP蛋白，降低其含量。

图18 瞬时转化后烟草叶表型

图19 叶总蛋白提取物中荧光测量

图20 GFP的WB检测

活性氧(ROS)信号传导在植物先天免疫反应中起着重要作用，可以直接抑制病原体的生长，也可作为信号分子促进植物免疫应答，其快速产生是植物防御系统激活的重要标志。在农杆菌注入一周后，用ROS试剂盒进行检测，以测定植物的免疫系统激活情况。结果显示NLR*的转入能使ROS显著上升，植物免疫系统显著激活(图21)。

图21 ROS含量的测量

四、生物安全模块验证

为了选择激发自杀开关的合适启动子，实验测试了4 个启动子，分别是组成型启动子 50Spro，乙酰丁香酮诱导型启动子Pvbp2，D-阿洛酮糖触发的PsiA和由4-异丙基苯甲酸诱导的Ptac/cuo启动子，使用GFPuv作为报告基因。结果显示组成型启动子50Spro表现出明显的绿色荧光，诱导型启动子中仅Pvbp2显示弱荧光(图22)。

由于诱导型启动子Pvbp2在启动子表征实验中的表达较弱，并且乙酰丁香酮具有毒性，实验者最终选择了50Spro作为启动子来验证光毒性蛋白的自杀作用。他们对50Spro进行了优化。他们从NCBI中提取了根癌农杆菌每个基因前的40 bp序列作为启动子，并分析启动子的保守位点，发现了12 个非保守位点，然后使用简并引物对这12 个碱基进行突变以构建突变文库(图23)，使用GFPuv作为报告基因进行启动子强度的筛查，得到了50Spro-e1与50Spro-e2两个启动子，其产生报告基因荧光强度显著高于未突变的启动子(图24)。

图22 启动子50Spro与启动子Pvbp2荧光表达强度检测

图23 农杆菌启动子非保守位点(a)的估计和测序结果(b)

图24 定向进化启动子荧光表达强度检测

确定启动子后，实验者选择了两种蛋白作为农杆菌自杀蛋白，分别是在黄绿光(540-585 nm)下产生活性氧(ROS) 的蛋白质KillerRed和在蓝光激发下产生有毒物质的蛋白质miniSOG。将携带有自杀蛋白基因的农杆菌在不同光强下诱导自杀，对细菌溶液的实验结果表明，细菌没有表现出来显著减少(图25)，这可能有利于细菌的保存和运输。而细菌平板实验表明，在光线照射下，工程细菌明显减少(图26)，说明了自杀系统起作用。

图25 KillRed自杀蛋白(A)和miniSOG自杀蛋白(B)对溶液中细菌的作用

图26 KillerRed对平板细菌的清除效果(暗对照，10 分钟，20 分钟， 30分钟)

PARTⅤ HP

在教育宣传上，他们开展了食品科普活动、青海省志愿者教学活动，学军中学宣传活动等多种活动，向中小学生和社会公众宣传食品健康知识和合成生物学知识。他们还积极进行学术交流，参加走近合成生物学-2023iGEM交流会与CCiC，和外校学生展开积极交流。为了了解公众对于他们项目的认知，他们多次对话利益相关者，并通过问卷调查了解公众对于农作物病虫害与合成生物学的认识。