用于监测体内多巴胺活性的下一代 GRAB 传感器
Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo
多巴胺（DA）在大脑中起着至关重要的作用，直接测量多巴胺能活性的能力对于了解其生理功能至关重要。因此，文章开发了基于红色荧光G蛋白偶联受体（GRAB）激活的DA传感器和以绿色荧光为输出信号的优化版本传感器。
为了响应细胞外DA，新一代传感器表现的红色和绿色都做到了荧光度大幅增加，具有亚细胞分辨率、亚秒级动力学和纳摩尔到亚微摩尔的亲和力。生成了名为rGRABDA1m的红色荧光DA传感器和 rGRABDA1h（分别缩写为rDA1m和rDA1h），动态范围类似于相应的第一代绿色DA传感器。
01、DA传感器的开发和体外表征
文章开发了红色荧光DA传感器，将cpmApple(构象敏感的红色荧光蛋白)表达模块与D2R（多巴胺 D2 受体）模块相结合，并系统地优化了插入位点、接头序列和cpmApple模块。文章通过在cpEGFP（构象敏感的绿色荧光蛋白）模块筛选近1000个变体产生了DA2h，一种高亲和力的绿色荧光DA传感器。
图1 .含传感器的细胞在显微镜下的荧光表现图像
使用HEK293T细胞和培养的大鼠皮质神经元测试传感器表征效果，由荧光图像与分析来看，文章构建的传感器在这两种细胞中没有明显的荧光降低，具有较好的表征效果。
图2.在大鼠皮质神经元中传感器的荧光表征图
02、急性小鼠脑切片中DA释放的成像
接下来，文章测试了开发的DA传感器是否可用于测量急性脑切片中内源性DA的释放。将用于表达rDA1m，rDA1h或DA2m的AAV注射到NAc中，NAc接受来自中脑多巴胺能神经元的强烈神经支配。注射两周后，制备急性脑切片，并使用光子成像结合电刺激来测量刺激诱发的DA释放。
图3.小鼠急性脑切片的研究制备与相应传感器的荧光检测图像
03、果蝇中DA的体内成像
文章生成了表达rDA1m的转基因果蝇，并使用体内光子成像测量了rDA2m传感器的荧光水平，同时呈现生理相关的刺激。当提供气味剂或身体电击时，我们观察到果蝇大脑内叶的表征多巴胺活性的荧光增加。
图4.二代优化传感器在果蝇体内的荧光检测图
文章比较了第一代和第二代绿色荧光DA传感器在苍蝇中的体内性能。与表达DA2m的果蝇相比，电刺激引起附近表达DA传感器的多巴胺能神经元（DANs）的强烈荧光增加，在表达DA1m的果蝇中观察到更高的反应。
图5.第一代传感器在果蝇体内的荧光检测
04、检测自由行为小鼠中的DA释放
文章测试传感器在小鼠体内的性能，通过表达光遗传学工具C1V1测量了背纹状体中的DA动力学，这是反映黑质致密部（SNc）多巴胺活性的主要靶标。
图6.自由小鼠传感器构建检测思路图
为了比较自然行为过程中DA2h和DA1h传感器的性能，文章在NAc磁芯的相对两侧表达DA1h和DA2h，并在雄性小鼠交配期间对其进行了传感器记录。通过数据分析得出结论，rDA1m能够检测自然行为过程中体内DA的释放，并且红色和绿色DA传感器检测到的行为相关DA响应在程度上相似。
图7.利用性行为小鼠比较两种传感器性能思路图
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