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XMU-China2023
课题：BNUZH-China
主要内容：利用木醋杆菌(Acetobacter xylinum)构建细菌纤维素(BC)复合支架来辅助大面积皮肤伤口的愈合。
关键词：细菌纤维素、BC、伤口修复、木醋杆菌
1.课题背景
创口的产生和愈合伴随着人们的一生。皮肤作为人体最大的器官，是人体抵抗外界环境伤害等的最重要屏障。日常生活中皮肤受损是很常见的，一般而言，只损害表皮的微小的创口易于愈合，但损害真皮层的深层创口往往需要很长的恢复时间。如烧伤、手术、慢性疾病如糖尿病带来的皮肤损伤，通常都难以恢复，而且很容易发生细菌感染，然后转化为炎症、溃疡，迫使患者需要进行截肢或其他的治疗手段，最坏的情况下可能导致死亡。
而且，由于社会逐渐老龄化，慢性病致使严重皮肤损伤的案例与日俱增。因此，加速创面愈合，提高创面愈合质量成为现代医学最具挑战性和边缘化的学科之一，而伤口愈合和组织再生的研究成为医学研究者日益关注的领域。考虑到目前大面积深度创口主要使用皮肤移植、皮瓣移植等传统方法存在的限制与问题，课题组提出了一种利用细菌纤维素(BC)作为真皮细胞生长支架，辅助伤口愈合的方法。
2.课题原理
细菌纤维素，bacterial cellulose(以下简称 BC)，是一种由微生物合成的具有高纯度，高持水性和强抗拉性的天然纳米级纤维素，可以由不同种类的细菌产生。其中，研究最广泛的细菌是醋杆菌,尤其是木醋杆菌Acetobacter xylinum。
促进全层皮肤组织缺损再生的核心是真皮组织的再生。真皮组织缺损程度影响伤口愈合过程。一旦真皮再生成功，皮肤移植中封闭伤口所需的皮片厚度将大大减少(甚至不需要取自体皮肤)，伤口的愈合质量将进一步提高。因此，辅助真皮再生的支架材料近年来受到越来越多的关注。
在真皮再生过程中，BC支架可以为细胞生长增殖提供载体，使细胞攀爬生长。这有助于更好地控制细胞生长的方向和趋势，为伤口组织的再生提供稳定的环境。值得一提的是，BC材料作为真皮再生支架具有以下优点。首先，BC具有独特的纳米纤维网络结构，支持细胞渗透和增殖。此外，BC具有高度的生物相容性，对参与伤口愈合的细胞如成纤维细胞和角质形成细胞没有细胞毒性。此外，BC具有调节细胞粘附的潜力。体外评价表明，BC在促进细胞粘附、增殖和细胞转移方面具有优异的作用。
虽然BC作为这种辅助真皮再生的支架，有非常多的优点，也有很广阔的应用前景，但它也有一个不可忽视的缺陷。由于人体中不能合成纤维素酶，这就导致已愈合伤口中的BC支架不能自主降解，甚至会一直留在人体中，这就可能引发不必要的免疫反应。因此，课题组也在此项目中设计了一个降解BC的系统，配合硬件，使这种BC支架更加安全，有更好的应用前景。
3. 项目设计
在此项目中，课题组设计了四个模块，各别发挥不同的功能，互相辅助完善。四个模块包括：基本的BC生产模块、促进愈合模块、蓝光激活的BC降解模块、红光激活的自杀模块。接下来一一介绍这四个模块的详细设计。
3.1BC生产
此模块主要负责生产真皮细胞支架BC。课题组选择了具有优良BC生产性能的木醋杆菌(Acetobacter xylinum)来生产BC，并在此基础上进行了初步改造。木醋杆菌，别名葡糖醋杆菌，是一种革兰氏阴性菌。它严格好氧，可以用于酿造糖醋，也是发酵培养红茶菌的菌种。课题组选用木醋杆菌生产BC，主要是因为这种细菌体内合成BC的路径已被研究透彻，且往届的BNDS_China 2020、TUST_China 2017等也使用这种菌成功合成了BC。更重要的是，据文献记述，木醋杆菌中BC的产量比其他普通的细菌高出很多倍，同时该BC的物理性质也非常良好。
为了进一步修饰BC，使其在帮助伤口愈合上发挥更好的效果，课题组考虑在BC膜的修饰中加入壳聚糖、透明质酸等小分子物质进行初步修饰交联。其中，壳聚糖(chitosan)具有优良的生物相容性、生物降解性、抗菌能力和促进伤口愈合的能力。是生物医用材料，尤其是组织再生材料的理想原料。透明质酸(hyaluronic acid)是细胞外基质的重要组成部分，在细胞信号传递和伤口愈合中起着重要作用。预计修饰后，BC膜的保水性、韧性等物理和机械性质都有显著性提升。
图 1 木醋杆菌生产BC膜修饰示意图
3.2 促进愈合
BC膜和小分子修饰物(壳聚糖，透明质酸)的存在下能够帮助真皮细胞的黏附及增长，因此间接地来说，BC在一定程度上有帮助伤口愈合的功能。但课题组希望通过其他方式，间接修饰皮肤伤口中的细胞，以增强皮肤细胞的增殖和抗菌能力，缩短伤口愈合的时间。此模块旨在提高系统的抗菌能力，促进伤口愈合功能。在提升抗菌性能方面，课题组选择使用抗菌肽LL-37。而促进伤口愈合方面，课题组设计通过表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，以下简称bFGF)和表皮生长因子(Epidermal growth factor，以下简称EGF)来实现这一功能。
3.2.1抗菌肽LL-37
抗菌方面，课题组选择抗菌肽LL-37，而不直接使用抗生素的原因是顾虑抗生素易产生耐药性等诸多副作用。而LL-37是哺乳动物中经过充分研究、最有前途和安全的抗菌肽之一。它具有广泛的抗菌谱，如革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、病毒、真菌、寄生虫。这样看来，需要长期并广泛使用，LL-37抗菌肽似乎有更好的前景。
3.2.2bFGF与EGF
伤口愈合的整个过程主要受生长因子的调控。在此过程中，外源性补充生长因子或提高内源性生长因子的活性均能促进伤口愈合。
碱性成纤维细胞生长因子(bfGF)具有广泛的促有丝分裂和细胞存活活性，并参与多种生物过程，包括胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、肿瘤生长和侵袭。它能够作用于全层皮肤细胞，调节细胞外基质成分的合成和沉积，增加角质形成细胞的迁移，促进成纤维细胞的迁移，从而加速肉芽组织的形成和再上皮化。摄入外源性bFGF还可增加创面VEGF、TGF-β等细胞因子的表达，从而促进血管内皮细胞的有丝分裂，增加内皮通透性，进一步促进毛细血管融合和大血管生成。
表皮生长因子(EGF)能促进表皮增殖和角化，上皮细胞分裂和增强细胞活性，促进皮肤和粘膜创面愈合。
3.2.3 具体实现方式
要使皮肤创面的细胞快速高效地分泌LL-37，EGF和bFGF，构建腺相关病毒(adeno associated virus, 以下简称AAV)是最有效的形式。因此，课题组计划使用AAV作为三种功能肽的载体。通过在伤口源下注射修饰的AAV，接触并侵入人体伤口的细胞，然后将目的基因转移到细胞内，使伤口内的成纤维细胞和其他细胞能够独立表达功能性多肽，实现促进愈合的作用。
图2 表达抗菌肽LL-37的基因回路(左)及其抗菌示意图(右)
图3 表达EGF的基因回路(左)及其促进愈合示意图(右)
图4表达bFGF的基因回路(左)及其促进愈合示意图(右)
3.3蓝光激活BC降解
此模块旨在启动工程化成纤维细胞ATCC CRL-2522(BJ)在蓝光下的纤维素酶分泌和表达，从而降解皮下无功能的纤维素支架为葡萄糖，同时防止疤痕和可能的免疫反应。这是通过引入蓝光激活的LightOn基因表达系统来实现的。后续通过慢病毒作为载体，感染不同的成纤维细胞，使这些成纤维细胞在蓝光的诱导下分泌表达相应的纤维素酶，分解BC。
LightOn系统是一个质粒系统，它使用组成型启动子CMV，负责启动表达单一的光敏转录因子GAVPO，在黑暗条件下不与目标转录单元结合，则目标基因不能表达。当右蓝光照射后，GAVPO会二聚化与目标转录单元的UASG序列结合，激活目标基因的表达。
LightOn系统诱导的三种细菌纤维素酶基因均来自Cellulomonas fimi，课题组将这三个基因拆分后，分别构建回路然后放到病毒中。上述基因个别功能如下
由于上述所有三个基因都是原核表达基因，因此课题组又设计了真核信号肽IL2-sig(人类白细胞介素2的信号肽，signal peptide of Homosapiens interleukin 2)在其C末端的融合，以使其能够在工程BJ中分泌表达。
图5 蓝光诱导的BC降解系统回路设计
3.4红光激活自杀
当BC完全降解后，为了防止工程BJ继续分泌纤维素酶而引起不必要的免疫反应，课题组设计了红光调控系统REDMAP来控制下游毒素蛋白MazF的表达。
MazF是一种大肠杆菌毒素。MazF被诱导后，可在单链RNA的ACA位点的第一个A和C之间产生特异性切割反应，从而有效抑制蛋白质合成。MazF还对哺乳动物的正常细胞和肿瘤细胞具有杀伤作用。在红光(660 nm)照射下，工程化成纤维细胞会合成MazF毒素，干扰自身蛋白质的正常合成，从而引发一系列反应，最终导致自身凋亡。这些细胞的凋亡机制将在远红光照射(730 nm)下终止。
红光/远红光自杀控制系统REDMAP对光非常敏感，它可以感应到低至0.1 mW cm-2的红光(远红光)。该系统的具体机制是：当系统暴露于红光 (660 nm)时，反式激活因子(FHY1-VP64)可以在光敏色素藻蓝胆素(PCB)存在的情况下特异性结合光传感器结构域(ΔPhyA-Gal4)，同时结合的蛋白质复合物易位到细胞核中，然后与其合成启动子结合(P5×UAS，5×UAS-PhCMVmin)，最终启动MazF的表达。另一方面，当系统暴露于远红光(730nm)后，反式激活因子从光传感器域(ΔPhyA–Gal4)解离，从而终止MazF的表达。同时，为了防止CMV强启动子直接激活MazF的表达，课题组将MazF区域调整到CMV启动子的上游。
图6 红光自杀系统回路设计
4. 硬件设计
通过我们的数据搜索和对Human Practice中对医生的采访，课题组发现协助伤口愈合的方法必须结合伤口清创。同时，也需要保护伤口，防止空气中的细菌对其进一步感染。因此为了解决上述问题，课题组设计了一种便携、遮光、可拆卸、可生物降解等特点的硬件。同时，这个硬件还可及时监测患者伤口情况，及时处理突发情况，确保治疗有效。
硬件中包括三大部分，聚乳酸(PLA)外壳、摄像头、印刷电路板。课题组设计的摄像头是为了能够在不打开保护套的情况下，通过与手机app相连，使患者或医护人员可以随时观察伤口情况，若发现情况不佳可随时打开保护套，进行相应的治疗。另外，印刷电路板上包含了三种颜色的LED灯：黄色、红色、蓝色。红色光负责诱导诱导自杀；蓝色光负责诱导BC的降解；而黄色光则负责照明，提供一定的亮度，使摄像头拍摄的画面更便于观察。摄像头，LED等的开关，都是可以通过手机app调控的。
b.外壳外面增加遮光的袖套
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