iGEM课题分享——Fisherly
iGEM 2022 HKUST
Achievements: Special Award - Safety and Security Award, GOLD medal
Nomination:Best Sustainable Development Impact, Best Integrated Human Practices, Best WIKI, Best Presentation
1、Background
香港是亚洲第二大以及全球第八大人均海产消费市场。2021年，香港海产进口量为33,000吨，海产产量高达112,000吨。海产无疑是香港人民餐桌上必不可少的一部分。但是由于鱼类运输和储存不当等问题，鱼类腐败的情况时有发生，鱼类腐败主要会带来三大问题：产品变质、食物浪费、生物胺中毒。生物胺中毒会出现皮疹、头晕恶心、呕吐、心悸呼吸困难等症状。
研究表明，生物胺可以作为衡量鱼类腐败程度的重要指标。通过表征生物胺浓度，可以反映鱼类是否腐败，但是目前的检测手段价格昂贵且耗时较长。所以2022年HKUST团队开发了一种方便快捷的生物胺检测试剂盒，旨在有效表征样本中的生物胺含量。
2、Design
生物胺传感器包含三个模块：感应模块、处理模块、色度输出模块。
1.感应模块
在底盘微生物中表达二胺氧化酶 （rDAO），将胞外的生物胺信号转换为底盘细胞能够胞内探测的H2O2信号。
图1 rDAO所介导的反应
通过建模分析发现增加rDAO胞内浓度可以使最后色度输出更明显，表征效果更好。但是rDAO具有二硫键，在原核生物细胞还原性的环境中不易形成，于是团队将rDAO与易位标签PelB相连，希望将rDAO运到还原性相对较弱的周质空间中形成，以增大其浓度。
图2 PelB-rDAO的表达
2.处理模块和色度输出模块
这两个模块在基因线路的设计上是相融合的，本质上是将H2O2作为输入，输出不同的色度，以此反映H2O2的浓度，从而反映生物胺的浓度。
2.1 TEV（烟草蚀纹病毒）蛋白酶表达模块
OxyR是E.coli的转录因子 ，有两个-SH（巯基），H2O2将OxyR氧化后，氧化型的OxyR便可以激活OxyR诱导型启动子katG，开启TEV蛋白酶的转录。
图3 OxyR的作用机制
TEV蛋白酶可以特异性识别氨基酸序列（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-cut site-Ser），并在谷氨酰胺和丝氨酸之间进行切割，从而实现对于红色荧光蛋白（RFP）的信号扩大以及对于绿色荧光蛋白（GFP）的信号减弱。
图4 TEV蛋白酶切割机制
2.2 针对RPF的降解救援以扩大RFP信号输出
用一种马铃薯Y病毒ssrA RNA在RFP的C末端添加LVA降解标签，该标签可以使被标记的蛋白被大肠杆菌细胞质中内源性的蛋白酶ClpXP和ClpAP识别和降解。
图5 低生物胺浓度时降解救援的表达通路
在低生物胺浓度时，过氧化氢浓度低，OxyR大部分处于还原型，TEV蛋白酶不表达。组成型表达的RFP因其C端带有LVA降解标签，被大肠杆菌内源性蛋白酶ClpXP和ClpAP识别降解，红色信号弱。
图6 高生物胺浓度时降解救援的表达通路
在高生物胺浓度时，过氧化氢浓度高，OxyR被氧化活化，从而诱导TEV蛋白酶表达，切割去除LVA标签，从而实现对于RFP的“救援”，扩大红色信号输出。
2.3 针对GFP的诱导降解系统
令GFP+LVA降解标签+TEV切割位点+抑制序列处于同一通路中。抑制序列来源于mRFP C末端的77个氨基酸，可以屏蔽LVA标签，因此抑制序列存在时内源性大肠杆菌蛋白酶ClpXP和ClpAP不能识别和降解GFP。
图7 低生物胺浓度时诱导降解的表达通路
在低生物胺浓度时，与之前原理相同，TEV蛋白酶不表达。组成型表达GFP-LVA-cut site-IS融合蛋白，IS可以掩蔽LVA标签不被识别降解，从而绿色信号强。
图8 高生物胺浓度时诱导降解的表达通路
在高生物胺浓度时，TEV蛋白酶表达。切割去除抑制序列，使得LVA标签暴露，GFP被诱导降解，绿色信号弱。
所以最终结果如下表所示。
3、Results
1.使用茚三酮与生物胺反应表征rDAO
分别将带有引导序列pelB-rDAO，rDAO和空载质粒转入底盘。过夜培养后，将过夜培养的细胞稀释至1.0 OD600，接种到液体LB，然后加入尸胺至600 ppm浓度，摇床培养，0 h、1 h、2 h分别用茚三酮法测尸胺浓度，得到结果如图9。
图9 pelB标签功能验证
对于-ve（空载对照），没有看到显著的减少或增加，说明组胺的蒸发和细菌培养对我们实验结果的影响可以忽略不计。rDAO组可见，随时间增加浓度有下降，代表rDAO表达正常，但0 h和1 h以及1 h和2 h之间无统计学意义上的显著差异，仅0 h和2 h存在显著差异，表明rDAO活性较低。pelB-rDAO组表明，pelB对于rDAO的活性有促进作用，使得随时间变化浓度变化极其显著，验证了增加pelB的合理性。
2.通过荧光检测表征OxyR诱导型启动子OxyS和KatG
构建6种表达载体，分别是oxySp-GFP-Pc-OxyR、katGp-RFP-Pc-OxyR、oxysp-GFP、pc-OxyR、katGp-RFP以及阴性对照组。
图10 oxySp-GFP-Pc-OxyR与katGp-RFP-Pc-OxyR基因线路
图11 GFP组归一化荧光/OD600v/s [H2O2]
图12 RFP组归一化荧光/OD600v/s [H2O2]
图13 oxySp-GFP-Pc-OxyR与katGp-RFP-Pc-OxyR荧光强度比较
在GFP相关组以及RFP组，阴性对照为基准，在分别表达GFP和RFP的系统中，随着过氧化氢浓度的升高，目的荧光强度也对应升高，表明两独立系统构建成功。
将两系统表达强度放在一起进行比较，可见RFP表达强度低于GFP，为了使最终浓度下颜色变化明显，需要进行优化，此实验对之后的操作具有指导意义。
3.降解救援机制中TEV蛋白酶切除LVA标签的表征
构建3种载体，pTac-TEV-Pc-RFP-LVA 、pTac-TEV-Pc-RFP 和空载质粒，分别转入底盘。无实验结果。
4.诱导降解机制中TEV蛋白酶切除抑制序列的表征
构建4种载体，pTac-TEV-Pc-GFP-LVA-CS、pTac-TEV-Pc-GFP-LVA- CS-IS、pTac-TEV-Pc -GFP和空载质粒，分别转入DH5α和BL21菌株中。
图14 TEV蛋白酶切除抑制序列效果表征
阴性对照为基准，灰色曲线表明，随着IPTG浓度升高，LVA促使GFP降解。绿色曲线在IPTG浓度较低时，TEV表达少，GFP带有IS掩蔽LVA，随着IPTG浓度上升，TEV表达上升促使GFP降解。
5.制作无细胞系统
通过比较后发现大肠杆菌BL21菌株更适合用于制作无细胞系统，之后团队对无细胞系统的组分和反应条件做了一系列优化，最终确定无细胞系统体系为1.5 mL，镁离子浓度为15 mM、PEG浓度为3%、ATP浓度为3 mM、3-PGA浓度为10 mM、孵育温度为37℃。
6.无细胞系统功能验证。
他们发现由OxyR调控表达的GFP浓度与过氧化氢浓度并不具有明显线性关系，据此，他们对于对应模板进行电泳检测，结果发现条带由弥散趋势，RNA污染严重，说明需要重新核验样品纯度。
图15 电泳检测结果
4、HP
市场：
1.1与Seafood Friday公司进行会议商讨，询问常规保藏操作以及质量检查问题，并询问他们对于设计的意见。
1.2 与M&C的高管商议，获得了他们对于目标用户以及硬件设计的意见。
1.3 提出了菜市场渔业的健康安全问题
1.4 在泰国进行线下调研
政策：
与负责监管批发鱼类市场运作的香港鱼类营销组织（FMO）和负责香港农业和渔业的渔农自然护理署（AFCD）的工作人员交流，了解到目前鱼类质量监管的不完善之处。
消费者：
提出了海产消费者诉求，需要更严格的商品控制，消费者的食物安全比价格重要。
【竞赛报名/项目咨询请加微信：mollywei007】
