文献标题：Quantification of small extracellular vesicles by size exclusion chromatography with fluorescence detection
Doi号：10.1021/acs.analchem.6b03348
关键词：sEVs、Dil dye、尺寸排阻色谱、TK6细胞
摘要：
通过排阻色谱荧光检测法定量分析细胞外膜小泡
一、背景介绍
目前通过简便有效的方法对细胞外膜小泡进行量化仍然具有较大的挑战，本文通过尺寸排阻色谱和荧光检测（SEC-FD）的方法，进行外膜囊泡EV的定量。去除细胞和细胞碎片后，0.5mL的样品（例如细胞培养基）将会和CM-Dil染料一起孵育，起到荧光标记的效果。培养液在填充有琼脂糖凝胶CL-4B的SEC柱上进行分离，对洗脱液在Ex553nm/Em570nm处进行荧光监测，以100nm的脂质体作为内标，评估了SEC-FD方法的分离效率。在细胞培养基分析中，我们获得了基于SEC-FD峰高和sEVs浓度的线性校准曲线。有十分靠近1的回归常数r2。
二、实验过程
本文尝试通过尺寸排阻色谱法，从样品的其他内源性成分中，例如脂蛋白和氨基酸，分离sEVs，并主要通过SEC-FD方法对在无血清培养基中培养的TK6细胞的sEVs分泌进行监测。
图1 高糊的定量意图
1.细胞培养
TK6细胞在无血清培养基中进行培养，之所以使用无血清，是因为血清中含有较多的EVs，将会影响定量效果。
2.脂质体准备：
使用脂质体试剂盒制备多层脂质体，使用过滤装置通过孔径为100nm的多孔聚碳酸酯膜，挤出获得的脂质体悬浮液，获得均匀大小的脂质体，用动态光散射法DLS测量脂质体粒径大小。
3.仪器准备：
向柱子中填充所选型号的琼脂糖凝胶，并和荧光光谱仪进行连接。
4.样品处理：
在4℃条件下，以300rpm离心10min以去除细胞颗粒，然后在10000rpm下离心30min，去除细胞碎片，取0.5mL的上清液转移到小管中，在37℃旋转的条件下和2μL的CM-Dil染料混合孵育30min。在脂质体内标的过程中，无需进行离心处理，直接与染料孵育即可。将培养液加到SEC柱上，用PBS-NaCl缓冲液进行洗脱，在553/570nm处进行荧光监测。
图2 内标结果示意图
5.外泌体定量：
对上述汇集出来的细胞培养基中的样品进行外泌体量化。再次通过离心去除细胞碎片后，将5mL样品和1mL的ExoQuick-TC（用于沉淀外泌体）在4℃混合孵育10h，接着使用ELISA试剂盒提供的CD63标准校正曲线，对样品中的外泌体进行定量。
6.其他：
由于在洗脱过程中将会出现两个峰，我们通过DLS和TEM对洗脱液中的EV粒径进行实时分析，发现6min时，洗脱出来的sEVs的平均粒径在100nm到300nm之间，说明六分钟时洗脱的就是外膜囊泡。同时测量蛋白质浓度的结果表明，在6min时收集的洗脱液的蛋白质含量增加，表明洗脱液中含有sEVs，能够检测到其表面蛋白质含量的增加。另外，虽然使用此型号的凝胶柱能够将sEVs和一些盐类和DNA等分离，但是对于分子大小差不多的某些脂蛋白，仍然无法分离，将被共同洗脱。通过标准的已知浓度的外泌体溶液，进行梯度稀释并进行SEC-FD分析，获得校准曲线。最后发现SEC-FD的峰值和sEV的浓度呈正比关系。
7.正式测量TK6细胞的外泌体浓度：
用纯净的无血清培养基和CM-Dil孵育来测定背景，其余操作按上述处理进行，得到荧光强度示意图如下所示，下方右图表示在培养时间1-12h内，实际上外膜囊泡的产生量是很少的，在12h后开始大量产生EVs。
图3 测量TK6细胞外泌体浓度结果示意图
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